BİLİM BAĞIMLILIĞI YENER Mİ DERSİNİZ???

46.TÜBİTAK ORTAÖĞRETİM ÖĞRENCLERİ PROJE YARIŞMASI FİNALİ

YEŞİLAY İLE İŞBİRLİĞİ

Yaptığımız ziyaretlerden ve sergi sırasında bizi ziyaret eden Bünyemin Bey(İzmir Şubesi Başkanı) ile anı fotoğraflarımız..

HALOPERİDOL İLE HEDEFLENMİŞ LİPOZOM SENTEZİ

Lipozomumuzu sentezlerken iki farklı tür lipid kullandık:

1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)  

Phosphatidylethanolamine  (PE)

                                                     

Hedefleme: HALOPERİDOL LİGANDINI İÇEREN LİPİDİN HAZIRLANMASI

Haloperidolün -OH grupları lipidin (PE) amino grupları (NH₃) ile bağlandı. Bu işlem de 

1,1'-Carbonyldiimidazole (CDI) çapraz bağlayıcı reaksiyonuyla yapıldı.

Haloperidol ile CDI 2 saat bekletilerek haloperidolün hidroksil (-OH) grupları minishaker'da 

(37 ºC, 1000 rpm) aktive edildi. 

2 saat bekleme süresince haloperidolümüze bağlanacak olan PE lipid porsiyonlandı. Bu işlem yapılırken 10 mg/mL'lık lipid stoğuna yeterli miktarda kloroform eklenerek istenilen stok konsantrasyonu sağlandı daha sonra 1,0 mg/mL'lik porsiyonlara bölündü. Kloroformun uçmaması ve lipidlerin bozulmaması için çalışmalar buzda yapıldı.

 CDI ile aktivasyon süresinin sonunda (2 saat) uygun miktarda lipid eklenerek Borat tamponunda (pH: 8,5) 750 rpm, 24ºC'de gece boyu reaksiyona bırakıldı.

CDI

Yeterli miktarda CDI tartılırken

CDI ve Haloperidol'ün Vorteks
yardımıyla karıştırılması

Lipidlerin porsiyonlanması

CDI ve Haloperidol'ün
uygun koşullarda
 2 saat boyunca minishakerda bırakılması

Oluşturulan ligandın uygun koşullarda gece boyu
minishaker'da bırakılması

LİPOZOM SENTEZİ

Lipozomlar geleneksel ince film hidrasyon yöntemiyle hazırlanmıştır. Lipozomların hazırlanmasında DMPC : PE : Chol kullanıldı. 3:1 (v/v) oranında kloroform : metanol karışımında hazırlanan lipid çözeltisi 50 mL lik yuvarlak dipli balona konuldu ve rotary evaporatörde 40 ^oC de organik çözgenler buharlaştırılarak lipid film tabakası oluşturuldu. Ardından pH’sı 7,4’e ayarlı tuzlu fosfat tamponu (phosphate buffer saline, PBS) film tabakasının üzerine eklendi ve balon hızlıca vortekslendi. Lipid film tabakasının katmanlar halinde kalkmasıyla çok tabakalı lipozom vezikülleri oluşur. Hidrasyon aşaması 40 ^oC’de 2 saat boyunca hafif çalkalama ile gerçekleştirildi. 2 saatin sonunda veziküller  Hamilton şırıngalarına alınarak ekstrüzyon işlemine başlandı. Ekstrüzyon işlemi 80 nm por çaplı polikarbonat membranlar kullanılarak, 11 kez örneğin membrandan geçirilmesiyle gerçekleştirildi. Elde edilen lipozom örnekleri sonraki aşamalarda kullanılmak üzere +4^oC’de depolandı.

Enkapsüle etmek istediğimiz materyal, hidrofilik karakterde ise lipozom sentezi sırasında hidrasyon aşamasında eklenir. Eğer hidrofobik karakterde ise film tabakası oluşturulmadan önce lipitlerle birlikte eklenir. Böylece hidrofobik maddeler, lipozomun membranında yer alırken; hidrofilik maddeler ise vezikülün içinde yer alır.

Yukarıda anlatılan işlemler, herhangi bir madde enkapsüle edilmemiş ve yüzeyine bağlanmış bir grup içermeyen lipozomlar için izlenen temel adımlardır. Biz çalışmamızda sentezlediğimiz lipozomlara sigma1 reseptörlerini tanıyıcı özellik kazandırmak için hedefleme ajanı olarak haloperidol bağladık. Lipozomların yapısında haloperidolün yer alması için sentez öncesinde lipide (PE) haloperidolü bağladık ve daha sonra yukarıdaki sentez metoduna göre lipozom hazırladık. Böylece dış kısımda haloperidol içeren lipozom veziküllerini elde etmiş olduk.



Extruder sistemi

KARAKTERİZASYON

BOYUT ANALİZİ:

İlk olarak hazırlanan veziküllerin parçacık boyut analizi ve yüzey zeta potansiyelleri* taze örneklerle bakıldı. Bu amaçla Dynamic light scattering (DLS) (Partikül boyutu ölçüm cihazı) kullanıldı.  Bunun için + 4 ^oC de tutulan örneklerden 50 µL alınarak saf su ile 1,0 mL ye tamamlandı ve üç tekrarlı ölçümler alındı.

*Zeta Potansiyel: Yüzey yükü

Örneği cihaza yerleştirmek
üzere seyreltirken

DLS cihazını çalıştırırken

     

DLS cihazı

          Ölçümler sonucunda elde edilen partikül boyutu ve zeta potansiyel değerleri boş lipozom ve haloperidol ile hedeflenmiş lipozom için aşağıdaki gibidir;

	Boyut (nm)	Zeta Potansiyel (mV)
Boş lipozom	108±37,08	-13,2±6,16
Haloperidol ile hedeflenmiş Lipozom	99±32,30	-31±5,32

                 
         

PBS TAMPONU HAZIRLAMA

PBS (Phosphate buffered saline) tamponu biyolojik uygulamalarda canlı organizmadaki pH koşullarını sağladığı için kullanılmaktadır. In vitro hücre kültürü çalışmalarında hücrelere uygulanacak örnekler PBS tamponunda hazırlanır.

Tampon hazırlamak için aşağıdaki maddeler belirtilen miktarlarda tartılarak bir beherin içine alındı. 

Malzemeler:

NaCl - 8,0 g/L

KCl - 0,2 g/L

Na₂HPO_{4 - 1,44 g/L}

KH₂PO_{4 -0,24 g/L}

500 mL tampon hazırlamak için beherin üzerine yaklaşık 490 mL distile su eklendi. Daha sonra manyetik karştırıcada çözününceye kadar karıştırıldı. Çözündükten sonra   beherdeki çözelti 500 mL'ye tamamlandı. Daha sonra uygun bir şişeye alınarak denemelerde kullanmak üzere +4ºC buzdolabında saklandı.

Gerekli kimyasalların uygun miktarlarda hassas teraziyle
tartılması

Manyetik karıştırıcıyla çözünürken

Karıştırma hızının ayarlanması (600 rpm)

Beherdeki tampon çözeltisinin balonjojeye aktarılması

Tampon çözeltimiz

HÜCRE KÜLTÜRÜ LABORATUVARINDA BİR GÜN-2: PASAJ İŞLEMİ

Pasaj: Flaskı %70 oranında kaplamış olan hücre kültürünün taze bir besi yeri ortamına aktarma işlemidir.

Bugün pasaj işleminde öncelikle dolaptan çıkarılan malzemeler oda sıcaklığına getirilmek amacıyla sıcak su banyosuna tabi tutuldu. Biyolojik güvenlik kabinine herhangi bir madde sokmadan önce her şey alkolle sterilize edildi. Biyolojik güvenlik kabini içerisinde besi yeri flask üzerine yapışarak büyüyen hücrelerden uzaklaştırıldı. Flasktaki besiyeri kalıntılarını uzaklaştırmak amaçlı hücre kültürü PBS (phosphate buffered saline) tamponu ile yıkandı ve işlem sonrası sıvı flasktan uzaklaştırıldı. Hücreleri yüzeyden kaldırmak için yüzeye tutunmalarını sağlayan proteinleri (integrin gibi) yıkıma uğratan tripsin enzimi ile muamele edildi. Tripsin enzimi 37 ºC'de aktif olduğundan hücre tipine göre flask inkübatörde 2-15 dk. bekletilmelidir. Böylece hücreler yüzeyden ayrılmış oldu. Bekleme sonrası tripsinin hücre içinde de yıkıma sebep olmaması için besi ortamı (DMEM) eklendi. Sonrasında hücreler başka bir flaska alınıp üzerine yeterli miktarda besiyeri eklendi. Böylece hücreler sonraki denemelerde kullanılmak üzere inkübatöre kaldırıldı. 



Pasaj malzemeleri



Besi yerinin hücre kültüründen ayrımı



PBS tamponu ile hücrelerin yıkanması





HÜCRE KÜLTÜRÜ LABORATUVARINDA BİR GÜN-1

Hücre kültürü laboratuvarında bir reseptör hedefleme çalışması... Biyokimya laboratuvarında hazırlanan ilaçlar 1/10 oranında seyreltilerek farklı hücre hatlarına uygulandı.


İlaç seyreltilmek üzere pipete alınırken

Seyreltilmiş ilaç hücrelere uygulanırken